IITC MRBP鼠尾血壓監測儀：黃芪-丹參藥對干預自發性高血壓大鼠腎損害的研究

山東中醫藥大學李偉團隊在《中草藥》期刊發表研究論文“基于miRNA測序技術探討黃芪-丹參藥對干預自發性高血壓大鼠腎損害的機制研究”，從轉錄組學角度探索黃芪-丹參藥對在自發性高血壓大鼠腎組織中的直接作用靶點，探討其改善高血壓腎損害的作用機制。

摘要

目的 基于微小RNA（microRNA，miRNA）高通量測序技術，探討黃芪-丹參藥對通過調控miRNA改善高血壓腎損害的作用機制。

方法 以9只WKY大鼠作為對照組，將自發性高血壓大鼠隨機分為模型組和黃芪-丹參藥對（3.4 g/kg）組，每組9只；黃芪-丹參藥對組給予黃芪-丹參藥對進行干預，觀察各組大鼠血壓及腎組織病理變化，并對各組大鼠腎組織進行miRNA測序。結果 經黃芪-丹參藥對干預4周后，與模型組比較，大鼠血壓降低（P<0.01），大鼠腎小球分葉不明顯，系膜區增生減輕。與對照組相比，模型組共篩選出115個差異表達miRNA，其中68個差異表達miRNA上調、47個差異表達miRNA下調；與模型組相比，黃芪-丹參藥對組篩選得到91個差異表達miRNA，其中67個差異表達miRNA上調、24個差異表達miRNA下調。差異表達miRNA的qRT-PCR驗證結果顯示，各組大鼠腎組織miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3p表達與miRNA測序結果趨勢一致。差異表達miRNA的靶基因預測及功能富集結果顯示，基因本體（GO）功能主要富集于陰離子跨膜轉運、突觸前、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等方面；京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路主要富集于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、自噬、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）信號通路等途徑。結論 miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p可能是黃芪-丹參藥對延緩高血壓腎損害進程的直接靶點。

實驗材料與儀器

實驗動物：24周齡SPF級雄性自發性高血壓大鼠18只，同周齡WKY大鼠9只

藥品與試劑：2 g黃芪中藥配方顆粒、1 g丹參中藥配方顆粒、QIAseq miRNA Library Kit、miRNeasy Mini Kit、MiPure Cell/Tissue miRNA Kit、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、TB GreenTM Ex TaqTM II Kit

儀器：IITC MRBP鼠尾血壓監測儀、光學顯微鏡、分光光度計、生物分析儀、測序儀

IITC MRBP鼠尾血壓監測儀

實驗方法與步驟

動物分組與給藥：取WKY大鼠9只作為對照組，將自發性高血壓大鼠隨機分為模型組和黃芪-丹參藥對（3.4 g/kg）組，每組9只。根據課題組前期研究，黃芪、丹參飲片用量分別為5.09、2.55 g/kg，分別將黃芪、丹參配方顆粒用量定為2.036、0.255 g/kg，藥物以0.9%氯化鈉溶液溶解。各給藥組灌胃給藥（10 mL/kg），對照組和模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續4周。

血壓測量：每周采用無創尾動脈加壓法測量血壓，記錄每只大鼠清醒狀態下尾動脈的收縮壓與舒張壓，連續測量3次。

腎組織病理觀察：給藥結束后，大鼠腹腔注射3%（80 mg/kg）過量麻醉處死，取腎組織，于中性多聚甲醛中固定48 h，切片（厚4 μm）后石蠟包埋，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，以中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

miRNA測序：隨機選取各組大鼠各3只，提取腎組織RNA并進行質量檢測和定量分析。使用QIAseq miRNA Library Kit構建雙端測序文庫，在Illumina Hiseq Xten測序平臺上測序。將每個具有miRNA序列的樣品讀長與已有miRNA數據庫和新miRNA的預測結果進行比較，計算miRNA表達水平，使用DESeq軟件分析樣品miRNA表達并篩選出P<0.05、倍數變化（FC）>1.5或<0.67的差異表達miRNA。

qRT-PCR驗證：選擇5個差異表達miRNA（miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-125b-1-3p）進行qRT-PCR驗證。以U6為內參，按照試劑盒說明書進行檢測。

靶基因預測及網絡構建：利用miRNA算法從miRNA-mRNA序列匹配情況及能量穩定性方面綜合預測差異表達miRNA靶基因，運用Cytoscape軟件構建差異表達miRNA與相應靶基因的網絡圖。

 研究結果與分析

血壓變化：與對照組比較，模型組大鼠收縮壓和舒張壓升高（P<0.01）；與模型組比較，給藥后第2周，黃芪-丹參藥對組大鼠收縮壓降低（P<0.05），給藥后第3、4周，收縮壓和舒張壓均降低（P<0.05、0.01）。

腎組織病理變化：對照組腎小球體積正常，系膜區未見明顯增生，系膜基質正常，未見腎小球硬化，腎小管上皮細胞形態正常；模型組腎小球體積輕度增大，分葉明顯，系膜區增生，系膜基質增多，伴中性粒細胞及其他炎性細胞浸潤；黃芪-丹參藥對組腎小球體積輕度增大，分葉不明顯，系膜區輕度增生，伴輕度中性粒細胞和其他炎性細胞浸潤。

差異表達miRNA：與對照組比較，模型組篩選得到115個差異表達miRNA，其中68個miRNA上調、47個miRNA下調；與模型組比較，黃芪-丹參藥對組篩選得到91個差異表達miRNA，其中67個miRNA上調、24個miRNA下調。miR-219a-5p、miR-3585-5p、miR-142-5p在模型組表達上調，而在黃芪-丹參藥對組表達下調。

GO功能富集分析：與對照組相比，模型組GO功能富集程度最高的分別為陰離子跨膜轉運、突觸前、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。與模型組相比，黃芪-丹參藥對組GO功能富集程度最高的分別為Ras蛋白信號轉導、囊泡膜、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。

KEGG通路富集分析：與對照組相比，模型組差異表達miRNA靶基因主要富集于mTOR信號通路、MAPK信號通路、自噬、AMPK信號通路、FoxO信號通路、TGF-β信號通路等途徑。與模型組相比，黃芪-丹參藥對組差異表達miRNA靶基因主要富集于MAPK信號通路、mTOR信號通路、自噬、AMPK信號通路、TGF-β信號通路、Ras信號通路等途徑。

 總結

該研究通過miRNA高通量測序技術，在自發性高血壓大鼠模型中鑒定出黃芪-丹參藥對干預后91個差異表達miRNA，其中miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p在模型組表達上調、藥對組表達下調，提示這三個miRNA可能是黃芪-丹參藥對延緩高血壓腎損害進程的直接靶點。KEGG通路分析顯示，黃芪-丹參藥對可能通過調控mTOR、MAPK、自噬、AMPK、TGF-β等信號通路發揮作用。該研究為高血壓腎損害的機制研究和中藥防治提供了依據。

 參考文獻

[1] 韓聰，姜月華，李偉. 黃芪-丹參藥對改善高血壓腎損害的研究進展 [J]. 中國實驗方劑學雜志，2019，25(12): 214-220. 

[2] Ding S, Liang Y S, Zhao M, et al. Decreased microRNA-142-3p/5p expression causes CD4+ T cell activation and B cell hyperstimulation in systemic lupus erythematosus [J]. Arthritis Rheum, 2012, 64(9): 2953-2963.