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Protein A親和填料的清潔和壽命

來源：百林科醫藥科技（上海）有限公司 2024年05月31日 09:11

得益于Protein A 親和填料

對抗體的高選擇性和體積去除率以及

穩健的雜質去除效果。

Protein A 親和填料作為抗體藥生產的行業標準

　　由于Protein A結合能力的局限性以及與Protein A樹脂相關的高成本，提高填料使用壽命的需求變得尤為重要。一般認為Protein A 填料的重復使用壽命由填料水解和填料污垢兩個因子所影響。

　　Protein A填料水解是指配基長時間暴露在清潔溶液(如*)中的降解。Protein A填料污垢是由于使用無效清洗液導致雜質在填料表面不斷積累導致。

填料配基水解(hydrolysis)

　　將全新的填料用不同濃度的堿性溶液循環 >250 小時來檢測Protein A配基的水解速率，評估不同*的濃度和溫度，用填料的DBC的下降數據來指征Protein A的填料水解速率。從圖1 中可看到，高濃度的*導致更高的配基水解速率，此外低溫能緩解一定的配基水解。

圖1，*濃度和溫度對DBC的影響

　　以上數據表明在低溫條件下可緩解配基水解速率，不同分子的DBC對低溫具有不同的敏感性。以7個模型蛋白作為代表來研究不同分子在不同溫度下的DBC，其中分子B是pI為7.9的Fc融合蛋白，其余為pI范圍為6.5-8.9的IgG1單克隆抗體。如圖2，可以看到不同分子對低溫有不同程度的載量降低，這在一定程度上將抵消低溫下對配基水解帶來的好處。同時，在生產過程中在冷環境內進行Protein A層析清晰步驟還可能在層析柱上產生放氣效應(outgassing)，不利于生產制造，所以低溫下*清洗并不是理想的解決方案。

圖2，使用添加劑來延緩配基的水解

　　選定不同的添加劑對配基水解具有不同的延緩效果，以分子E為代表，分別添加蔗糖、乙二醇和丙二醇作為*的添加劑，評估其清潔液循環之后的DBC。由圖3可知，添加劑對配基水解的延緩有一定的作用，丙二醇/蔗糖和乙二醇的配體穩定性分別比0.1 M NaOH的基礎情況提高了2倍和3倍。

圖3，比較堿性清潔溶液和
非堿性清潔溶液的填料污垢

　　選定3種分子(1個單抗+2個Fc融合蛋白)做為代表研究填料清洗后的污垢。為了最大程度上污染層析柱，3個代表分子的澄清收獲液在Protein A的層析柱上進行10個cycle，每個cycle只做到洗脫步驟，沒有做層析柱清潔，最后將層析柱拆下來分裝，分別用不同清洗液在不同溫度下孵育2小時，并用平衡液清洗3次，用原始的填料作為對照。此時填料上殘余的是清洗不干凈的污垢。將最后的填料懸浮液稀釋到1倍的SDS PAGE loading buffer中，80℃孵育10分鐘后取上清并進行SDS PAGE分析。SDS PAGE上越多蛋白表示越多的清洗不干凈的污垢。

　　從圖4中可以清楚地看出，0.1M和0.3M(泳道2、4、5)濃度較高的*作為清潔溶液的效果明顯優于0.02M (泳道3)。這一趨勢在所有3種測試分子中都是一致的。0.3M NaOH對分子A的反應優于0.1M NaOH，但對其他兩種情況的反應相當。此外，pH 11非堿清洗液(泳道 6)對分子A的清洗效果良好，但對其他分子的清洗效果不佳。這支持了無堿清洗液不適合作為平臺清洗策略的理論。有趣的是，溫度并沒有影響樹脂清洗的效率。在更高濃度的*(0.3M)下，在環境溫度和低溫(泳道4和5)下都獲得了類似的結果。

圖4

　　為了更好表征清洗時間對清洗效果，繼續以分子B為代表(Fc融合蛋白，pI 7.9), 用B分子污染的填料分別不同孵育時間。如圖5所示，隨著孵育時間增加，泳道的蛋白越少，清洗效果越好。但是增加孵育時間可能導致更多的配基降解，所以孵育時間和配基降解應該綜合考慮以取得最佳的填料壽命。

圖5，填料壽命研究

　　根據以上數據，選定0.1 M NaOH和0.1 M NaOH+20% EtGly為清潔溶液，評估其使用次數。由圖6可知，在添加了20% EthGly情況下層析柱壽命幾乎翻了一倍，且產品質量未見下降。使用乙二醇作為添加劑來清潔親和層析柱會導致洗脫體積隨著循環數增加而緩慢增加，洗脫體積不影響相應的產品質量，所以乙二醇任然可以作為親和層析的清潔添加劑。

圖6

　　百林科Protein A 親和層析介質MaXtar® ARPA，采用的高耐堿性的蛋白A配基，具有完全的自主知識產權，采用創新的綠色化學成球工藝、偶聯方式、配基，具有卓越的耐堿性能。在每個循環均使用0.5M NaOH，15min進行CIP處理，運行200個cycle以后，其動態結合載量(DBC)依然保留其原始載量的90%以上。

圖7

　　參考文獻：

　　Zhang J, Siva S, Caple R, Ghose S, Gronke R. Maximizing the functional lifetime of Protein A resins. Biotechnol Prog. 2017 May;33(3):708-715. doi: 10.1002/btpr.2448. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28218470.

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