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有關細胞培養污染問題全面陳述

來源：上海撫生實業有限公司 2024年03月18日 13:51

　　細胞培養是指將細胞從動物或植物體內取出，然后在適宜的人工環境中生長的過程。細胞可以在培養前直接從組織中取出并通過酶或機械方法進行解離，也可以來源于已建立的細胞系或細胞株。細胞常規培養是在細胞房中進行，在超凈工作臺或生物安全柜中，把細胞處理好，根據需要加入細胞培養基，放入細胞培養瓶/皿或細胞培養板中，再放到帶有5% CO2 的37℃恒溫培養箱中培養。

　　細胞培養過程中如果操作不當或者條件控制不合適容易受到化學或者生物因素的污染。凡混入細胞培養環境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染，細胞污染不能全被消除，但能減少其發生的頻率和后果的嚴重性。細胞污染根據污染源主要可以分為化學性，物理性和生物性污染。

　　一、化學性污染

　　培養環境中許多化學物質都可以引起細胞的污染?；瘜W物質并不總是抑制細胞的生長，某些化學物質如激素就可促進細胞的生長。不同細胞對化學物質污染的反應是不一樣的。未純化的物質、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學性污染的來源。

　　細胞培養的必需養分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細胞產生毒性。同樣，不同細胞系其最佳培養條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養中應嚴格控制。

　　玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內表面)是最常見的化學性污染。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內毒素等物質對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質的超純水。

　　動物血清是細胞培養中常用的天然培養基，但血清又是潛在的生物及化學污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產工藝及質量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來源及培養基的成分等因素。在進行一系列實驗時，為了保證實驗的可重復性，最好選用同一批次的血清。

　　細胞培養使用的所有物質都應是高純度的，并經過機構的鑒定，實驗者應對上述成分進行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養液及試劑也是非常重要的，應該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。

　　二、物理性污染

　　物理性污染常常被人們所忽視或被籠統地歸為化學性污染。物理性污染通過影響細胞培養體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝。培養環境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產生影響。細胞、培養液或其它培養試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。通過實驗室的合理設計及建立規范的操作規程，可以減少環境中物理因素對細胞的影響。孵箱應放在溫度較恒定的環境中，周圍不能放置能引起機械振動的設備，如離心機。培養液及培養試劑應放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養液從冰箱中取出后應在室溫中放置一段時間后再進行實驗，以避免過冷的溫度對細胞的影響。

　　三、微生物污染

　　由于體外培養的細胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細胞微生物污染一旦發生往往是無法挽救的。一般在細胞受到污染早期或污染較輕時，能及時處理并除去污染物，部分細胞還有可能得到挽救。

　　不同的微生物污染物對細胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細胞形態和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細菌增殖迅速，能在很短的時間內抑制細胞生長或產生有毒物質殺滅細胞。

　　1、霉菌污染

　　種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數在培養液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細胞上及細胞周邊生長。

　　處理：確認是霉菌污染，如果細胞種類不是特別珍貴，直接放棄，并將實驗環節消毒。

　　2、細菌污染

　　細菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養液可預防和排除個別一般少量細菌的污染。一旦發生細菌污染很容易發現，多數情況下培養液短時間內變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明顯渾濁現象；有時靜置的培養液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以明確細菌種類；有的培養液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養基內陸入少量培養液，37℃培養以檢測。

　　處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時后再換常規培養液，有時在早期污染時此法有效。細胞培養中用抗生素多為預防細菌污染，一半多聯合應用。一旦發生污染后再使用抗生素常常難以除掉，有的抗生素只有抑菌作用而無殺菌效應。

　　3、支原體污染

　　支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨立生活的微生物.約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性.可為圓形、絲狀或梨形。

　　支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6-8.0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。

　　支原體污染細胞后.培養液可不發生混濁.多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解.因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢.甚至從培養器皿脫落。為確定有無支原體污染可做如下檢測：

　　a:相差顯微境檢測；b:熒光染色法；c:電鏡檢查；d:DNA分子條文檢查或支原體培養等方法。處理：市場上有多種支原體清除試劑盒，效果比較好。

　　4、酵母污染

　　酵母到處存在，并能在合適的環境中快速生長。酵母污染很容易觀察到，培養物變渾濁，尤其在后期。一般PH值變化很小，嚴重時，PH值升高。顯微鏡下呈卵圓形或球形顆粒，有些會芽生較小顆粒。

　　5、病毒污染

　　組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。

　　盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

　　6、細胞交叉污染

　　細胞污染和細菌污染不同，細胞污染是由于在培養過程中各種細胞同時進行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養細胞不同種類之間發生混亂，細胞生長特性，形態發生變化。有些變化輕微，不易察覺，有些則可能由于污染的細胞具有生長優勢而最終壓過原來細胞而導致細胞生長的抑制，最終死亡。污染過的細胞由于種類不純，無法進行實驗研究。

　　7、預防污染方法

　　需要考慮的注意事項：

　　1、進入培養間時，保持雙手潔凈。使用肥皂全清洗后，酒精干燥(不用紙巾)；

　　2、佩戴手套(保證手套可以被消毒)；

　　3、穿著帶有松緊袖口的實驗服；

　　4、不要隨便觸碰無關物品(例如：電話、門把手、甚至說是整理頭發等)；

　　5、避免佩戴手表、戒指和其他首飾；

　　6、脫去在其他地方接觸過動物的衣服；

　　7、患有感冒的人員需佩戴面罩。

　　良好規范的操作：

　　1、為您的CO2培養箱建立一套日常的標準清洗程序(清潔區域需要包括培養箱周圍的區域，特別是培養箱的頂部)；

　　2、經常檢查實驗室的其他設備是否受到污染(例如：洗手池/離心機等)；

　　3、有計劃放置您的培養箱，盡量減少開門時間和不必要的移動；

　　4、快速開關CO2培養箱；

　　5、限制使用同一培養箱的人數；

　　6、盡快清除溢出物，之后用酒精清潔；

　　7、舍棄水純化系統最初得到的水。

　　注重培養過程：

　　1、細胞培養需要經常性地檢查是否被污染；

　　2、使用半個開放培養皿盛放組織培養基。開口放置于培養箱中1至4個小時。蓋上培養皿蓋子。37℃培養24-72小時。觀察現象。

　　3、早期發現污染可以提高培養物存活的幾率；

　　4、不要混用、共享培養皿或培養基；

　　5、不要令盛放培養基的容器開口放置過長時間；

　　6、全被污染的培養涉及物需要用高壓滅菌消毒；

　　7、盡量使用一次性預滅菌培養耗材。

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