作者：王濤 ，戴明珠，李延川，彭逸，李春啟

作者單位：無限極（中國）有限公司；杭州環特生物科技股份有限公司

本文發表于：《中國實驗動物學報》2022年1月30日

核心摘要 ：

目的：通過體外細胞和體內斑馬魚實驗，快速評價復方中藥提取物增強免疫力作用，并進行初步機制研究。

方法：在體外實驗中利用 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞初步評價復方中藥提取物的生物活性；再以酒石酸長春瑞濱誘導建立斑馬魚活體免疫低下模型，分別從斑馬魚巨噬細胞生成和吞噬功能、T細胞生成及相關炎癥、免疫基因的表達等多個方面，觀察復方中藥提取物的干預作用。

結果：體外實驗中復方中藥提取物有良好的生物安全性，其在250 μg/mL 條件下可提高酒石酸長春瑞濱誘導后的RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞存活率。體內研究表明，復方中藥提取物在 222、667、2000 μg/mL 濃度時均可明顯改善長春瑞濱誘發的斑馬魚巨噬細胞數量的減少，同時增強巨噬細胞吞噬能力；222、667μg/mL濃度可顯著增加T細胞熒光強度；222、667、2000 μg/mL 濃度均可明顯恢復模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達量被下調的情況，并均可以顯著下調模型斑馬魚TNF-α 基因相對表達量；復方中藥提取物222μg/mL可顯著上調免疫因子 IL-12 基因表達量，在2000μg/mL 時顯著上調IFN-γ 基因表達量。

結論：體內、外實驗表明復方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用。

● 綜述

免疫力可以保護機體不受侵害，近年來，由于生態失衡所導致的免疫性疾病越來越多，西藥不能起到預防作用，治療效果不甚明顯且存在毒副作用。而中藥及其提取物在中醫藥基礎理論指導下，擅治未病，講究協調和平衡，且毒副作用小，所以中藥及其提取物增強免疫力一直是新研究方向。已有實驗研究表明，靈芝多糖和生物堿均能明顯增強小鼠巨噬細胞吞噬能力和 T 淋巴細胞轉化能力，同時可提高小鼠外周血中 IFN-γ 的表達水平。五味子多糖、白術多糖及內酯均具有抗氧化和增強機體免疫力活性；菟絲子提取物是有效的抗菌劑，抗氧化劑和抗炎劑；黨參和茯苓在多種急性和慢性炎癥的不同實驗模型中顯示抗炎活性。然而大部分研究都是以傳統的大小鼠為動物模型進行評價，具有造模時間長、成本高、通量小等缺點。

斑馬魚是一種國際認可的新型模式生物，其引人注目的優勢是胚胎發育的透明性，基于高通量的檢測體系，以及短時-高效-低費篩選。隨著“3R原則”的推行與實施，其在藥物的靶點鑒別、疾病的模型開發和毒性評價中應用越來越廣泛。本研究采用體外細胞實驗和體內斑馬魚免疫低下模型探究復方中藥提取物對免疫力的影響，從RAW264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞活性，斑馬魚巨噬細胞數量及其吞噬功能，T細胞數量，免疫相關基因水平多方面考察復方中藥提取物的生物安全性與增強免疫作用，對復方中藥提取物增強免疫功能進行驗證并提供理論依據。

● 實驗方法

1. RAW264.7細胞培養及復方中藥提取物處理

取生長狀態良好的RAW264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，每孔依次加入復方中藥提取物62.5、125、250、500及1000μg/mL濃度的培養基，測定各孔吸光度（OD）值，確定復方中藥提取物處理濃度；

除正常對照孔及溶劑對照孔（0.1%DMSO）外，其余每孔均加入12.5μg/mL濃度的培養基后，再依次加入復方中藥提取物27.8、83.3、250μg/mL濃度以及陽性對照組25μg/mL濃度的培養基，測定各孔OD值，評價復方中藥提取物對RAW264.7細胞存活率的影響。

   2. 復方中藥提取物安全性考察

選取受精后2dpf的Tg（mpeg1：EGFP）轉基因斑馬魚，設置加藥組：復方中藥提取物62.5、125、250、500、1000、2000μg/mL；同時設置正常對照組。記錄孵育至 6 dpf 時斑馬魚各臟器毒性表型與死亡情況，確定復方中藥提取物對正常斑馬魚的檢測濃度（MTC）。

3. 復方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞生成的影響

取2dpf的Tg轉基因斑馬魚，設置加藥組：復方中藥提取物222、667、2000μg/mL；同時設置對照組，建立斑馬魚巨噬細胞減少癥模型。在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚尾部靜脈血管中巨噬細胞熒光強度（S1），并拍照。

   4. 復方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的影響

選取2dpfTg轉基因斑馬魚，均靜脈注射紅色熒光微球作為異物以建立斑馬魚巨噬細胞吞噬功能模型。將模型斑馬魚設置加藥組：復方中藥提取物 222、667、2000 μg/mL；同時設置對照組，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內（全身）熒光微球殘留的數目（N）。

5. 復方中藥提取物對斑馬魚 T 細胞的影響及初步機制研究

選取2dpf Tg轉基因斑馬魚，設置加藥組：復方中藥提取物 222、667、2000 μg/mL；同時設置對照組：陽性對照百令膠囊 60.0 μg/mL，正常對照組及模型對照組，建立斑馬魚 T 細胞減少癥模型。

在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚 T 細胞熒光強度（S2），分析對 T 細胞生成的影響；收集斑馬魚樣本，提取各濃度組斑馬魚總 RNA，以 β-actin 作為基因表達的內參，檢測目的基因腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、重組激活型基因-1（rag1）、重組激活型基因-2（rag2）、白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和 γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的轉 錄 水 平 ， 進 行 復 方 中 藥 提 取 物 增 強 免 疫 力 初 步 機 制 研 究。

● 實驗結果

1. 復方中藥提取物對 RAW 264.7 細胞存活率的影響

當復方中藥提取物濃度為62.5~250μg/mL時，RAW264.7細胞存活率均>90.0%；當復方中藥提取物濃度為500μg/mL時，RAW264.7 細胞存活率下降為 84.0%。故確定復方中藥提取物對RAW264.7細胞安全濃度為250μg/mL（見表1）。

由表2可知，酒石酸長春瑞賓可導致RAW264.7細胞存活率顯著下降；同時復方中藥提取物3倍濃度梯度干預后，細胞存活率呈劑量依賴性升高，復方中藥提取物250μg/mL可顯著提高RAW264.7細胞存活率（P<0.01）。

2、復方中藥提取物對斑馬魚的 MTC

在實驗終點，復方中藥提取物62.5~2000μg/mL濃度組斑馬魚均未見明顯異常，各臟器和行為狀態與正常斑馬魚相似（見圖1）。提示復方中藥提取物對正常斑馬魚的MTC為2000μg/mL。

3. 復方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞生成的影響

由統計結果可知（表3，圖2），酒石酸長春瑞賓可導致斑馬魚免疫力低下，表現為與正常對照組比較，酒石酸長春瑞賓組斑馬魚中巨噬細胞熒光強度顯著降低；復方中藥提取物低、中、高3倍濃度梯度干預后，巨噬細胞熒光強度均顯著升高，巨噬細胞減少的改善功效分別為18%（P< 0.05）、21%（P<0.01）和22%（P<0.01）。

4、復方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的影響

由統計結果可知（表 4，圖 3），與模型對照組比較，復方中藥提取物低、中、高3個濃度組均可明顯減少斑馬魚體內熒光微球殘留數目（P<0.05），表明復方中藥提取物具有促巨噬細胞吞噬功能作用。

5. 復方中藥提取物對斑馬魚 T 細胞生成的影響

由統計結果可知（表5，圖4），與正常對照組比較，模型對照組T細胞熒光強度極顯著降低，表明酒石酸長春瑞賓可誘導斑馬魚免疫抑制。與模型對照組比較，復方中藥提取物中濃度T細胞熒光強度顯著升高（P<0.01）；但高濃度對T細胞熒光強度無升高作用且呈現降低的作用趨勢。

6、復方中藥提取物對斑馬魚 T 細胞的影響及初步機制研究

6.1 RNA 濃度及純度

在實驗終點，提取斑馬魚總RNA，測定 RNA 濃度及純度，結果表明 A260/A280比值均在1.88~2.03之間，表明提取得到斑馬魚總RNA質量較好，可用于后續q-PCR 實驗（見表6）。

6.2 對重組激活型基因rag1和rag2的影響

根據基因相對表達量公式計算，與正常對照組比較，模型對照組 rag1、rag2 基因相對表達量均顯著下調（P<0.01），復方中藥提取物干預后，低、中、高濃度組rag1、rag2基因相對表達量均顯著恢復（見表7）。

6.3 對免疫因子 IL-12 和 IFN-γ 的影響

與正常對照組比較，模型對照組 IL-12 基因相對表達量極顯著下調（P<0.001），復方中藥提取物干預后，在實驗終點，低濃度組 IL-12 基因相對表達量極顯著上升（P < 0.001），中、高濃度組出現負反饋調節。

與正常對照組比較，模型對照組 IFN-γ 基因相對表達量顯著下調（P<0.01），復方中藥提取物3倍濃度梯度干預后，IFN-γ 基因相對表達量呈劑量依賴性恢復，復方中藥提取物高濃度組 IFN-γ 基因相對表達量極顯著上升（P <0.001）（見表8）。

6.4 對致炎癥因子 TNF-α 的影響

模型對照組TNF-α基因相對表達量（1.000）與正常對照組（0.006）比較極顯著上調（P<0.001）。復方中藥提取物低、中、高濃度組 TNF-α 基因相對表達量分別為 0.023、0.002 和 0.008（P<0.001），提示復方中藥提取物可顯著下調 TNF-α 基因相對表達量（見表 9）。

● 結論

在體外實驗中復方中藥提取物有良好的生物安全性，且可明顯提高酒石酸長春瑞濱誘導后小鼠單核巨噬細胞的存活率。體內研究表明，復方中藥提取物可明顯改善長春瑞濱誘發的斑馬魚巨噬細胞及T細胞數量的減少，同時增強體內巨噬細胞的活性和吞噬能力；復方中藥提取物可明顯恢復模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達量被下調的情況，復方中藥提取物上調免疫因子 IL-12 的表達量、IFN-γ 基因的相對表達量，復方中藥提取物可顯著下調 TNF-α 基因相對表達量。體內、外實驗表明復方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用。

綜上所述，復方中藥提取物具有明顯的抗炎及增強免疫力的作用。本研究可為復方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發提供指導性依據。